Phân tích khối phổ là gì? Các nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa phân tích khối phổ

Phân tích khối phổ (mass spectrometry, MS) là kỹ thuật phân tích cho phép xác định khối lượng phân tử, thành phần nguyên tố và cấu trúc hóa học của chất bằng cách chuyển mẫu thành các ion, tách chúng theo tỷ số khối lượng/điện tích (m/z) và ghi nhận cường độ tín hiệu. Kết quả đầu ra là phổ khối, thể hiện các đỉnh ion đặc trưng cho từng thành phần mẫu, cho phép định danh và định lượng với độ nhạy cao.

Ứng dụng chính của MS bao gồm phân tích dược phẩm, proteomics, metabolomics, phân tích môi trường, kiểm nghiệm thực phẩm và nghiên cứu hóa học cơ bản. Tính linh hoạt của MS thể hiện qua khả năng kết hợp với kỹ thuật tách sắc ký (GC-MS, LC-MS) hoặc ion mobility spectrometry để tăng khả năng phân tích hỗn hợp phức tạp.

• Xác định khối lượng chính xác và thành phần phân tử (exact mass).
• Định lượng vết tạp chất, chất ô nhiễm, dư lượng thuốc trừ sâu.
• Phân tích cấu trúc: xác định vị trí nhóm chức và phân mảnh.

Nguyên lý cơ bản

Nguyên lý hoạt động của MS gồm ba bước cơ bản: ion hóa mẫu, phân tích khối (mass analysis) và phát hiện (detection). Trong bước ion hóa, phân tử được chuyển thành ion dương hoặc ion âm bằng các phương pháp thích hợp. Các ion này sau đó được gia tốc vào buồng phân tích, nơi chúng bị tách theo tỷ số m/z dưới tác dụng của điện trường, từ trường hoặc cả hai.

Công thức cơ bản biểu diễn tỷ số khối lượng trên điện tích:

$m/z = \frac{m}{z}$ trong đó m là khối lượng của ion (đơn vị Dalton), z là điện tích của ion (số nguyên). Phổ khối ghi nhận cường độ (intensity) tương ứng mỗi giá trị m/z, phản ánh số lượng ion và khả năng xuất hiện của các phân tử phân mảnh.

Ba thành phần chính của khối phổ kế gồm:

1. Nguồn ion hóa (Ion Source): tạo ion từ mẫu.
2. Bộ phận phân tích khối (Mass Analyzer): tách ion theo m/z.
3. Bộ phát hiện (Detector): ghi nhận số lượng và cường độ ion.

Ion hóa mẫu

Ion hóa là bước quan trọng quyết định khả năng phân tích và độ nhạy của MS. Có nhiều phương pháp ion hóa, mỗi phương pháp phù hợp với loại mẫu và mục đích phân tích khác nhau:

• Electron Ionization (EI): sử dụng chùm electron năng lượng cao (70 eV) để đánh bật electron khỏi phân tử, tạo ion dương và nhiều ion phân mảnh; phù hợp cho hợp chất nhỏ bền nhiệt và thường dùng trong GC-MS.
• Electrospray Ionization (ESI): phun dung dịch mẫu dưới áp suất cao qua kim phun, tạo giọt tích điện; dung môi bay hơi, để lại ion phân tử; thích hợp cho phân tử sinh học lớn như protein, peptide, axit nucleic.
• Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI): trộn mẫu với ma trận hữu cơ, sau đó bắn laser để bay hơi và ion hóa; ưu thế trong phân tích protein, peptide và polymer với khối lượng từ vài nghìn đến hàng trăm nghìn Dalton.
• Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI): ion hóa hóa học dưới áp suất khí quyển, kết hợp phun sương và phóng điện để tạo ion; thích hợp cho phân tử trung bình, chi phí thiết bị thấp hơn ESI.

Mỗi nguồn ion hóa tạo ra các ion có mức độ phân mảnh khác nhau, ảnh hưởng đến phổ khối cuối cùng. Khi lựa chọn phương pháp ion hóa, cần cân bằng giữa độ nhạy, độ phân giải khối và khả năng bảo toàn cấu trúc phân tử nguyên vẹn.

Khối phân tích (Mass Analyzers)

Bộ phận phân tích khối (mass analyzer) tách ion theo tỷ số m/z, quyết định độ phân giải và độ chính xác khối của hệ thống. Các loại analyzer phổ biến bao gồm:

Loại Analyzer	Nguyên lý	Độ phân giải	Ưu/nhược điểm
Quadrupole	Điện trường dao động qua 4 thanh kim loại	Trung bình (~1000)	Chi phí thấp, tốc độ cao; độ phân giải hạn chế
Time-of-Flight (TOF)	Phân tích theo thời gian bay ion	Cao (>10 000)	Phổ rộng, độ phân giải cao; đòi hỏi nguồn ion xung
Ion Trap	Lưu giữ ion trong bẫy điện từ	Trung bình (~5000)	Hỗ trợ MSn; giới hạn dung lượng ion
Orbitrap	Dao động ion trong trường điện thế xoắn ốc	Rất cao (>100 000)	Độ chính xác khối siêu cao; chi phí và độ phức tạp lớn
FT-ICR	Dao động ion trong từ trường mạnh	Cao nhất (>1 000 000)	Độ phân giải và độ chính xác tuyệt đối; yêu cầu từ trường lớn, chi phí rất cao

Việc chọn analyzer phụ thuộc vào yêu cầu độ phân giải, phạm vi khối, tốc độ đo và ngân sách. Kết hợp nhiều analyzer (ví dụ Q-TOF hay LTQ-Orbitrap) giúp tận dụng ưu điểm của từng loại để phân tích phức hợp đa dạng mẫu trong proteomics và phân tích hợp chất tự nhiên.

Bộ phát hiện và thu tín hiệu

Bộ phát hiện (detector) trong khối phổ kế đảm nhận nhiệm vụ ghi nhận các ion sau khi tách m/z. Detector dạng electron multiplier (EM) khuếch đại tín hiệu ion qua chuỗi điện tử, cho phép phát hiện nhiều ion cùng lúc với độ nhạy cao. Detector dạng microchannel plate (MCP) tương tự nhưng với cấu trúc kênh nhỏ, cải thiện độ tuyến tính và độ phân giải thời gian.

Chế độ hoạt động của detector gồm hai cơ bản:

• Counting mode: đếm từng xung ion, phù hợp nồng độ thấp, độ nhạy cao nhưng giới hạn throughput.
• Analog mode: đo dòng điện tổng, phù hợp dải động rộng, xử lý nồng độ cao nhưng ít nhạy với ion ít gặp.

Đặc tính của detector quyết định giới hạn phát hiện (LOD) và dải động (dynamic range) của hệ thống. Trong proteomics, detector EM thường được ưu tiên để thu ion peptide hiếm gặp, trong khi phân tích hợp chất nồng độ cao có thể sử dụng analog mode.

Chuỗi MSⁿ và phân tích cấu trúc

Chuỗi MSⁿ (tandem mass spectrometry) cho phép tách ion gốc (precursor ion) trong MS¹, phá vỡ qua va chạm (CID, HCD) tạo ion mảnh, sau đó phân tích tiếp trong MS² hoặc cao hơn MS³... MSⁿ. Kỹ thuật này giúp xác định cấu trúc chi tiết bằng cách phân tích các mẫu phân mảnh liên tiếp.

Phương pháp CID (Collision-Induced Dissociation) sử dụng khí trung tính (N₂, Ar) làm môi trường va chạm, ion gốc va chạm với khí, truyền động năng, gây vỡ liên kết hóa học. HCD (Higher-energy CID) ở Orbitrap đem lại phổ mảnh sạch và độ phân giải cao hơn.

Chuỗi MSⁿ quan trọng trong:

1. Proteomics: xác định vị trí cắt peptide và biến đổi hậu dịch mã.
2. Metabolomics: phân biệt đồng phân và xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên.
3. Phân tích polymer và oligomer: xác định khối lượng lặp lại và cấu trúc nhánh.

Xử lý dữ liệu và thư viện phổ

Sau khi thu được phổ khối, bước tiếp theo là xử lý dữ liệu (data processing) bao gồm: hiệu chỉnh nền (baseline correction), chuẩn hóa cường độ, lọc nhiễu và xác định đỉnh (peak picking). Phần mềm như Thermo Xcalibur, SCIEX OS và Bruker Compass hỗ trợ tự động hóa quy trình này.

So sánh phổ với thư viện chuẩn (spectral library) là cách định danh nhanh hợp chất. Thư viện nổi tiếng như NIST MS Library chứa hàng triệu phổ khối gốc và mảnh. Quá trình so sánh thường sử dụng chỉ số tương đồng (spectral similarity) như cosine similarity để đánh giá độ khớp.

Thư viện	Số lượng phổ	Chuyên biệt
NIST MS Library	600 000+	Hướng hóa hữu cơ và thuốc
MoNA	200 000+	Metabolomics và tự nhiên
GNPS	250 000+	Proteomics & metabolomics

Việc quản lý thư viện nội bộ cho mẫu đặc thù giúp tăng độ chính xác định danh và giảm sai sót do biến thể nguồn ion hóa hoặc phân tích.

Định lượng mẫu

MS có thể định lượng mẫu theo hai cách:

• Tuyệt đối: sử dụng chuẩn nội (internal standard) đồng vị đánh dấu (isotope-labelled standard). Chuẩn nội cộng với hiệu chuẩn ngoài (external calibration curve) giúp xác định nồng độ chính xác tuyệt đối.
• Tương đối: dựa vào cường độ tương đối của đỉnh ion, phổ biến trong proteomics (label-free quantification) hoặc với nhãn đồng vị (SILAC, TMT) hỗ trợ đa mẫu đồng thời.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định theo tín hiệu/nhiễu (S/N) với ngưỡng 3:1 cho LOD và 10:1 cho LOQ. Độ tuyến tính của đáp ứng MS phụ thuộc vào bước ion hóa, analyzer và detector.

Ứng dụng chính

MS là công cụ không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực:

• Dược phẩm: phát triển thuốc, xác định tạp chất, kiểm định độ tinh khiết (FDA guidelines).
• Proteomics & Metabolomics: xác định và định lượng protein, peptide, small molecules trong sinh học hệ thống (HUPO).
• Môi trường: phát hiện chất ô nhiễm, kim loại nặng, dư lượng thuốc trừ sâu.
• Thực phẩm: phân tích dinh dưỡng, phát hiện giả mạo, dư lượng kháng sinh.
• Pháp y: xác định chất độc, cồn, phân tích dược động học sau tử thi.

Thách thức và xu hướng phát triển

Tăng độ nhạy và phân giải mà không tăng nhiễu nền vẫn là thách thức chính, đòi hỏi cải tiến nguồn ion hóa và analyzer. Thiết bị MS di động (portable MS) với miniaturized ion trap đang trở thành xu hướng, cho phép phân tích hiện trường nhanh chóng (NCBI PMC).

Kết hợp AI/ML trong xử lý phổ tự động, nhận diện mẫu phân mảnh và dự đoán cấu trúc (in silico fragmentation) giúp rút ngắn thời gian phân tích và giảm phụ thuộc vào thư viện. Các mô hình mạng nơ-ron sâu (deep neural networks) đã chứng minh khả năng dự đoán phổ MS/MS chính xác trên 85% (ACS Anal. Chem.).

Tích hợp MS với kỹ thuật khác như ion mobility spectrometry (IMS-MS) cung cấp thêm chiều phân tách dựa trên hình dạng ion, mở rộng khả năng phân tích đồng phân (Agilent IMS-MS).

Tài liệu tham khảo

1. NIST – Mass Spectrometry
2. IUPAC – What is Mass Spectrometry
3. Thermo Fisher Scientific – Mass Spectrometry
4. ScienceDirect – Mass Spectrometry
5. ACS Analytical Chemistry – Advances in MS